На чем основан ферментативный катализ?
Основу всех жизненных процессов составляют тысячи химических реакций, катализируемых ферментами. Значение ферментов точно и образно определил И.П.Павлов, назвав их «возбудителями жизни». Нарушения в работе ферментов ведут к возникновению тяжелых заболеваний – фенилкетонурия, гликогенозы, галактоземия, тирозинемия или существенному снижению качества жизни – дислипопротеинемии, гемофилия.
Известно, что для осуществления химической реакции необходимо, чтобы реагирующие вещества имели суммарную энергию выше, чем величина, называемая энергетическим барьером реакции. Для характеристики величины энергетического барьера Аррениус ввел понятие энергии активации. Преодоление энергии активации в химической реакции достигается либо увеличением энергии взаимодействующих молекул, например нагреванием, облучением, повышением давления, либо снижением требуемых для реакции затрат энергии (т.е. энергии активации) при помощи катализаторов.
Величина энергии активации с ферментом и без него
По своей функции ферменты являются биологическими катализаторами. Сущность действия ферментов, так же как неорганических катализаторов, заключается:
- в активации молекул реагирующих веществ,
- в активации молекул реагирующих веществ,
- в разбиении реакции на несколько стадий, энергетический барьер каждой из которых ниже такового общей реакции.
Однако энергетически невозможные реакции ферменты катализировать не будут, они ускоряют только те реакции, которые могут идти в данных условиях.
Сходство и отличия ферментов и неорганических катализаторов
Сходство |
Отличия |
|
|
NB! Ускорение реакций при помощи ферментов весьма значительно, например:
А. Уреаза ускоряет реакцию разложения вполне устойчивой мочевины до аммиака и воды в 1013 раз, поэтому при инфекции мочевых путей (появление бактериальной уреазы) моча приобретает аммиачный запах.
Б. Рассмотрим реакцию разложения пероксида водорода:
2Н2О2 → О2 + 2Н2О
Если скорость реакции без катализатора принять за единицу, то в присутствии платиновой черни скорость реакции увеличивается в 2×104 раза и энергия активации снижается с 18 до 12 ккал/моль, в присутствии фермента каталазы скорость реакции возрастает в 2×1011 раза с энергией активации 2 ккал/моль.
|
Скорость реакции, |
Энергия активации, ккал/моль |
|
| Без катализатора | 1 | 18 |
| С платиновой чернью | 2×104 | 12 |
| С ферментом каталаза | 2×1011 | 2 |
Ферментативный катализ имеет свои особенности
Этапы катализа
В ферментативной реакции можно выделить следующие этапы:
1. Присоединение субстрата (S) к ферменту (E) с образованием фермент-субстратного комплекса (E-S).
2. Преобразование фермент-субстратного комплекса в один или несколько переходных комплексов (E-X) за одну или несколько стадий.
3. Превращение переходного комплекса в комплекс фермент-продукт (E-P).
4. Отделение конечных продуктов от фермента.
Механизмы катализа
| Доноры | Акцепторы |
-СООН | -СОО— -NH2 -S— -O— |
1. Кислотно-основной катализ – в активном центре фермента находятся группы специфичных аминокислотных остатков, которые являются хорошими донорами или акцепторами протонов. Такие группы представляют собой мощные катализаторы многих органических реакций.
2. Ковалентный катализ – ферменты реагируют со своими субстратами, образуя при помощи ковалентных связей очень нестабильные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе внутримолекулярных перестроек образуются продукты реакции.
Типы ферментативных реакций
1. Тип «пинг-понг» – фермент сначала взаимодействует с субстратом А, отбирая у него какие либо химические группы и превращая в соответствующий продукт. Затем к ферменту присоединяется субстрат В, получающий эти химические группы. Примером являются реакции переноса аминогрупп от аминокислот на кетокислоты — трансаминирование.
Ферментативная реакция по типу «пинг-понг»
2. Тип последовательных реакций – к ферменту последовательно присоединяются субстраты А и В, образуя «тройной комплекс», после чего осуществляется катализ. Продукты реакции также последовательно отщепляются от фермента.
Ферментативная реакция по типу «последовательных реакций»
3. Тип случайных взаимодействий – субстраты А и В присоединяются к ферменту в любом порядке, неупорядоченно, и после катализа так же отщепляются.
Ферментативная реакция по типу «случайных взаимодействий»
Ферменты имеют белковую природу
Давно выяснено, что все ферменты являются белками и обладают всеми свойствами белков. Поэтому, подобно белкам, ферменты делятся на простые и сложные.
Простые ферменты состоят только из аминокислот – например, пепсин , трипсин, лизоцим.
Сложные ферменты (холоферменты) имеют в своем составе белковую часть, состоящую из аминокислот – апофермент, и небелковую часть – кофактор. Примером сложных ферментов являются сукцинатдегидрогеназа (содержит ФАД), аминотрансферазы (содержат пиридоксальфосфат), различные пероксидазы (содержат гем), лактатдегидрогеназа (содержит Zn2+), амилаза (содержит Ca2+).
Кофактор, в свою очередь, может называться коферментом (НАД+, НАДФ+, ФМН, ФАД, биотин) или простетической группой (гем, олигосахариды, ионы металлов Fe2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+).
• если связь кофактора с белком прочная, то в этом случае говорят о наличии простетической группы,
• но если в качестве кофактора выступает производное витамина – то его называют коферментом, независимо от прочности связи.
Для осуществления катализа необходим полноценный комплекс апобелка и кофактора, по отдельности катализ они осуществить не могут. Кофактор входит в состав активного центра, участвует в связывании субстрата или в его превращении.
Как многие белки, ферменты могут быть мономерами, т.е. состоять из одной субъединицы, и полимерами, состоящими из нескольких субъединиц.
Структурно-функциональная организация ферментов
В составе фермента выделяют области, выполняющие различную функцию:
1. Активный центр – комбинация аминокислотных остатков (обычно 12-16), обеспечивающая непосредственное связывание с молекулой субстрата и осуществляющая катализ. Аминокислотные радикалы в активном центре могут находиться в любом сочетании, при этом рядом располагаются аминокислоты, значительно удаленные друг от друга в линейной цепи. В активном центре выделяют два участка:
- якорный (контактный, связывающий) – отвечает за связывание и ориентацию субстрата в активном центре,
- каталитический – непосредственно отвечает за осуществление реакции.
Схема строения ферментов
У ферментов, имеющих в своем составе несколько мономеров, может быть несколько активных центров по числу субъединиц. Также две и более субъединицы могут формировать один активный центр.
У сложных ферментов в активном центре обязательно расположены функциональные группы кофактора. Например, в реакции превращения пировиноградной кислоты (пируват) в молочную кислоту (лактат) сначала к апоферменту лактатдегидрогеназы присоединяется НАД, формируется активный центр, и только потом входит пируват.
Схема формирования сложного фермента
2. Аллостерический центр (allos – чужой) – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы, называемой активатором или ингибитором (или эффектором, модулятором, регулятором), вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции.
Аллостерические ферменты являются полимерными белками, активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.
Схема строения аллостерического фермента
В качестве такого регулятора может выступать продукт данной или одной из последующих реакций, субстрат реакции или иное вещество (см «Регуляция активности ферментов«).
Изоферменты
Изоферменты – это молекулярные формы одного и того же фермента, возникшие в результате небольших генетических различий в первичной структуре фермента, но катализирующие одну и ту же реакцию. Изоферменты отличаются сродством к субстрату, максимальной скоростью катализируемой реакции, чувствительностью к ингибиторам и активаторам, условиями работы (оптимум pH и температуры).
Как правило, изоферменты имеют четвертичную структуру, т.е. состоят из двух или более субъединиц. Например, димерный фермент креатинкиназа (роль КК) представлен тремя изоферментными формами, составленными из двух типов субъединиц: M (англ. muscle – мышца) и B (англ. brain – мозг). Креатинкиназа-1 (КК-1) состоит из субъединиц типа B и локализуется в головном мозге, креатинкиназа-2 (КК-2) – по одной М- и В-субъединице, наиболее активна в миокарде, креатинкиназа-3 (КК-3) содержит две М-субъединицы, специфична для скелетной мышцы. Определение активности разных изоферментов КК в сыворотке крови имеет клинико-диагностическое значение.
Изоферменты креатинкиназы
Изоферменты лактатдегидрогеназы
Также существует пять изоферментов лактатдегидрогеназы (роль ЛДГ) – фермента, участвующего в обмене глюкозы. Отличия между ними заключаются в разном соотношении субъединиц Н (англ. heart – сердце) и М (англ. muscle – мышца). Лактатдегидрогеназы типов 1 (Н4) и 2 (H3M1) присутствуют в тканях с аэробным обменом (миокард, мозг, корковый слой почек), обладают высоким сродством к молочной кислоте (лактату) и превращают его в пируват. Изоферменты ЛДГ-4 (H1M3) и ЛДГ-5 (М4) находятся в тканях, склонных к анаэробному обмену (печень, скелетные мышцы, кожа, мозговой слой почек), обладают низким сродством к лактату и катализируют превращение пирувата в лактат. В тканях с промежуточным типом обмена (селезенка, поджелудочная железа, надпочечники, лимфатические узлы) преобладает ЛДГ-3 (H2M2). Определение активности разных изоферментов ЛДГ в сыворотке крови имеет клинико-диагностическое значение.
Еще одним примером изоферментов является группа гексокиназ, которые присоединяют фосфатную группу к моносахаридам гексозам и вовлекают их в реакции клеточного метаболизма. Из четырех изоферментов выделяется гексокиназа IV (глюкокиназа), которая отличается от остальных изоферментов высокой специфичностью к глюкозе, низким сродством к ней и нечувствительностью к ингибированию продуктом реакции.
Мультиферментные комплексы
В мультиферментном комплексе несколько ферментов прочно связаны между собой в единый комплекс и осуществляют ряд последовательных реакций, в которых продукт реакции непосредственно передается на следующий фермент и является только его субстратом. Возникает туннельный эффект, т.е. субстрат попадает в созданный ферментами «туннель». В результате промежуточные метаболиты избегают контакта с окружающей средой, снижается время их перехода к следующему активному центру и значительно ускоряется скорость реакции.
Строение мульферментного комплекса
Например,
- пируватдегидрогеназный комплекс (пируватдегидрогеназа), превращающий пируват в ацетил-SКоА,
- α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс (в цикле трикарбоновых кислот) превращающий α-кетоглутарат в сукцинил-SКоА,
- комплекс под названием «синтаза жирных кислот» (или пальмитатсинтаза), синтезирующий пальмитиновую кислоту
- карбамоилфосфатсинтетаза, первый фермент синтеза мочевины в печени и синтеза пиримидиновых оснований
Абзимы
Абзимами называются антитела, имеющие каталитическую функцию (англ. abzymes, antibodies as enzymes) и катализирующие конкретные реакции. Такая способность возникает в результате формирования промежуточного продукта при связывании антитела с антигеном (имитация переходного комплекса E-X ферментативной реакции).
Что означает выражение "активность фермента"?
Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов.
В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции, а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).
Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:
- масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата,
- время, потраченное на реакцию,
- количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.
NB! Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:
1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?
Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.
В практике обычно используют:
- единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
- единицы времени – минута, час, секунда,
- единицы массы или объема – грамм (производные кг, мг), литр (мл).
В настоящее время в основном уже применяются единицы активности – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.
Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.
NB! Например, известно,
- что 1 г пепсина расщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
- если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г/с×мл.
Принципы количественного определения активности ферментов
1. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.
2. Необходимо наличие избытка субстрата, чтобы в течение установленного времени работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.
От чего зависит активность ферментов? Свойства ферментов
1. Зависимость скорости реакции от температуры
Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента. Повышение скорости реакции при приближении к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул.
Зависимость скорости реакции от температуры
Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем.
Классическим примером является фермент аденилаткиназа, выдерживающая температуру 100ªС при рН равном 1,0.
NB! Ферменты могут быть очень чувствительны к изменению температуры:
- у сиамских кошек мордочка, кончики ушей, хвоста, лапок черного цвета. В этих областях температура всего на 0,5°С ниже, чем в центральных областях тела. Но это позволяет работать ферменту, образующему пигмент в волосяных луковицах, при малейшем повышении температуры фермент инактивируется,
- обратный случай — при понижении температуры окружающего воздуха у зайца-беляка пигментообразующий фермент инактивируется и заяц получает белую шубку,
- противовирусный белок интерферон начинает синтезироваться в клетках только при достижении температуры тела 38°С,
NB! Бывают и уникальные ситуации:
- для большинства людей повышение температуры тела на 5°С (до 42°С) несовместимо с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых спортсменов обнаружено, что при марафонском беге их температура тела составила около 40°С, максимальная зарегистрированная температура тела была 44°С.
2. Зависимость скорости реакции от рН
Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.
Данная особенность ферментов имеет существенное значение для организма в его адаптации к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Сдвиги величины рН вне- и внутри клетки играет роль в патогенезе заболеваний, изменяя активность ферментов разных метаболических путей.
Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.
Зависимость скорости реакции от величины pH
Зависимость активности от кислотности среды объясняется наличием аминокислот в структуре фермента, заряд которых изменяется при сдвиге рН (глутамат, аспартат, лизин, аргинин, гистидин).
Изменение заряда радикалов этих аминокислот приводит к изменению их ионного взаимодействия при формировании третичной структуры белка, изменению его заряда и появлению другой конфигурации активного центра и, следовательно, субстрат связывается или не связывается с активным центром.
NB! Изменение активности ферментов при сдвиге рН может нести и адаптивные функции. Так, например, в печени ферменты глюконеогенеза требуют меньшей рН, чем ферменты гликолиза, что удачно сочетается с закислением жидкостей организма при голодании или физической нагрузке.
Для большинства людей сдвиги величины рН крови за пределы 6,8-7,8 (при норме 7,35-7,45) несовместимы с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых марафонцев обнаружено снижение рН крови в конце дистанции до 6,8-7,0. И ведь при этом они сохраняли работоспособность!
3. Зависимость от количества фермента
При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.
Зависимость скорости реакции
от количества фермента
4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата
При увеличении концентрации субстрата скорость реакции сначала возрастает, т.к. к катализу добавляемых молекул субстрата подключаются новые и новые молекулы фермента. Т.е. скорость накопления продукта возрастает, и это означает увеличение активности фермента. Затем наблюдается эффект насыщения (плато на кривой), когда все молекулы фермента заняты молекулами субстрата и непрерывно ведут катализ, здесь скорость реакции максимальна. В некоторых случаях, при дальнейшем увеличении концентрации субстрата между его молекулами возникает конкуренция за активный центр фермента и активность фермента (скорость реакции) снижается.
Зависимость скорости реакции
от концентрации субстрата
Зависимость фермента от количества субстрата описывает ферментативная кинетика
Уравнения Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка
Общую теорию ферментативной кинетики и зависимость активности фермента от субстрата.описали Л.Михаэлис и М.Л.Ментен, выразив его в своем уравнении. Бриггс и Холдейн усовершенствовали их уравнение, введя введя в него константу Михаэлиса (Km), определяемую экспериментально.
Уравнение Михаэлиса-Ментен показывает взаимосвязь максимально возможной скорости, реальной скорости реакции, константы Михаэлиса и концентрации субстрата. Так как пользоваться графиком, построенным в прямых координатах V и [S] для точных расчетов неудобно, то Г.Лайнуивер и Д.Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна в обратные координаты.
Уравнение Михаэлиса-Ментен
Уравнение Лайнуивера-Бэрка
NB! На самом деле уравнение Михаэлиса-Ментен в данном виде предложили Бриггс и Холдейн, но в честь основоположников оно носит название Михаэлиса-Ментен.
Выделяют три основных решения уравнения Михаэлиса-Ментен:
1. Концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса ([S] = Km).
В этом случае, решая уравнение Михаэлиса-Ментен, получаем, что скорость реакции V будет равна половине максимальной Vmax.(V = ½ Vmax).
В математическом смысле Km соответствует концентрации субстрата при которой скорость реакции равна половине максимальной. Ее биологический смысл заключается в характеристике сродства фермента к субстрату, а именно: увеличение величины Кm означает снижение сродства фермента к субстрату.
2. Концентрация субстрата значительно больше Km ([S] >> Km). В этом случае величиной Km можно пренебречь, при решении получим, что скорость реакции максимальна (плато на графике).
3. Концентрация субстрата значительно меньше Km ([S] << Km). В этом случае, знаменатель уравнения мало изменяется при изменении [S], а величина скорости реакции V прямо пропорциональна [S] (график линеен).
График уравнения Михаэлиса-Ментен
График уравнения Лайнуивера-Берка
Ферменты избирательны в своем действии
Специфичность, т.е. высокая избирательность действия ферментов, основана на комплементарности структуры субстрата и активного центра фермента.
1. Стереоспецифичность – катализ только одного из стереоизомеров, например:
- специфичность к L- или D-аминокислотам – например, почти все ферменты человека взаимодействуют с L-аминокислотами,
- специфичность к цис- и транс-изомерам. Например, аспартаза реагирует только с транс-изомером – фумаровой кислотой, но не с малеиновой кислотой (цис-изомер).
Стереоспецифичность аспартазы к транс-изомеру субстрата
2. Абсолютная специфичность – фермент производит катализ только одного вещества. Например, каталаза разрушает перекись водорода, аргиназа расщепляет только аргинин, уреаза расщепляет только мочевину, глюкокиназа фосфорилирует только D-глюкозу.
Реакция расщепления мочевины
3. Групповая специфичность – катализ субстратов с общими структурными особенностями, т.е. при наличии определенной связи или химической группы, например:
- наличие пептидной связи: • бактериальный фермент субтилизин специфичен к пептидной связи независимо от строения образующих ее аминокислот, • пепсин катализирует разрыв пептидной связи, образованной аминогруппами ароматических аминокислот, • тромбин в своих субстратах расщепляет пептидную связь только между аргинином и глицином,
- наличие α1,4-гликозидных связей в крахмале и гликогене — их гидролизует α-амилаза слюнной и поджелудочной желез,
- наличие ОН-группы: алкогольдегидрогеназа окисляет до альдегидов одноатомные спирты (этанол, метанол, пропанол).
4. Относительная групповая специфичность – превращение субстратов с некоторыми общими признаками. Например, цитохром Р450 окисляет только гидрофобные вещества, которых насчитывается около 7000.
Механизмы специфичности
В общем виде все сводится к комплементарному взаимодействию фермента и субстрата. При этом функциональные группы субстрата взаимодействуют с соответствующими им функциональными группами фермента. Наличие субстратной специфичности объясняют две гипотезы:
1. Теория Фишера (модель «жесткой матрицы», «ключ-замок») – активный центр фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую.
Схематичное представление теории Фишера
2. Теория Кошланда (модель «индуцированного соответствия», «рука-перчатка») – подразумевает гибкость активного центра. Присоединение субстрата к якорному участку фермента вызывает изменение конфигурации каталитического центра таким образом, чтобы его форма соответствовала форме субстрата.
Схематичное представление теории Кошланда
Как регулируется активность ферментов?
Активность ферментов в клетке непостоянна во времени. Ферменты чутко реагируют на ситуацию, в которой оказывается клетка, на факторы, воздействующие на нее как снаружи, так и изнутри. Главная цель такой чувствительности ферментов – отреагировать на изменение окружающей среды, приспособить клетку к новым условиям, дать должный ответ на гормональные и иные стимулы, а в некоторых ситуациях – предоставить клетке шанс выжить.
Способы регуляции активности ферментов
В клетке имеется несколько способов регуляции активности ферментов – одни способы подходят для любых ферментов, другие более специфичны.
1.Доступность субстрата или кофермента
Роль оксалоацетата для работы ЦТК
Здесь работает закон действия масс – фундаментальный закон химической кинетики: при постоянной температуре скорость химической реакции пропорциональна произведению концентрации реагирующих веществ. Или упрощенно – скорость, с которой вещества реагируют друг с другом, зависит от их концентрации. Таким образом, изменение количества хотя бы одного из субстратов прекращает или начинает реакцию.
Например, для цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) таким субстратом является оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота). Наличие оксалоацетата «подталкивает» реакции цикла, что позволяет вовлекать в окисление молекулы ацетил-SКоА.
2. Компартментализация
Компартментализация – это сосредоточение ферментов и их субстратов в одном компартменте (одной органелле) – в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, лизосомах, ядре, плазматической мембране и т.п.
Например, ферменты цикла трикарбоновых кислот и β-окисления жирных кислот расположены в митохондриях, ферменты синтеза белка – в рибосомах.
3. Генетическая регуляция
Генетическая регуляция (изменение количества фермента) может происходить в результате увеличения или снижения его синтеза. С этой точки зрения ферменты можно подразделить на три группы:
- Конституитивные – такие ферменты, которые образуются в клетке постоянно, независимо от наличия субстрата (нейрональная NO-синтаза, ферменты гликолиза, β-окисления жирных кислот, репарации ДНК).
- Индуцируемые – синтез этих ферментов возрастает при наличии соответствующих стимулов — индукторов.
- Репрессируемые – образование таких ферментов в клетке при необходимости подавляется.
Изменение скорости синтеза фермента (индукция или репрессия) обычно зависит от количества определенных гормонов или метаболитов процесса.
Примеры индуцируемых ферментов:
- гормоны глюкокортикоиды стимулируют синтез ферментов глюконеогенеза, что обеспечивает стабильность концентрации глюкозы в крови при длительном голоданиии и устойчивость ЦНС к стрессу,
- исчезновение пищеварительных ферментов при длительном голодании и индукция их синтеза в восстановительный период в результате возобновления секреции гормонов ЖКТ,
- при беременности и после родов в молочной железе индуцируется синтез фермента лактозосинтазы под воздействием лактотропного гормона,
- токсические субстраты (например, этанол и барбитураты) стимулируют в печени синтез «своего» изофермента цитохрома Р450, который окисляет и обезвреживает эти вещества,
- при активации цитокинами моноцитов и макрофагов в них начинается синтез индуцируемой NO-синтазы.
Примеры репрессируемых ферментов:
- в печени репрессия фермента синтеза холестерола ГМГ-SKoA-редуктазы под влиянием холестерина и желчных кислот,
- в печени репрессия синтеза ферментов глюконеогенеза под действием инсулина,
- подавление синтеза триптофана бактериями при деятельности триптофанового оперона.
4. Ограниченный (частичный) протеолиз проферментов
Ограниченный (частичный) протеолиз проферментов подразумевает, что синтез некоторых ферментов осуществляется в виде более крупного предшественника и при поступлении в нужное место этот фермент активируется через отщепление от него одного или нескольких пептидных фрагментов. Подобный механизм защищает внутриклеточные структуры от повреждений.
Схема активации фермента способом
«ограниченного протеолиза»
Примером служит активация протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта (трипсиноген, пепсиноген, прокарбоксипептидазы), факторов свертывающей системы крови, лизосомальных ферментов (катепсины).
Секреция ряда ферментов за пределы клетки в неактивном состоянии позволяет предохранить клетки от повреждения (пищеварительные ферменты) или сохранить белок в плазме крови до наступления определенного момента (факторы свертывания крови, белки системы комплемента, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем).
5. Аллостерическая регуляция
Аллостерические ферменты построены из двух и более субъединиц: одни субъединицы содержат каталитический центр, другие имеют аллостерический центр и являются регуляторными. Присоединение эффектора к аллостерической (регуляторной) субъединице изменяет конформацию белка и, соответственно, активность каталитической субъединицы.
Аллостерические ферменты обычно стоят в начале метаболических путей, и от их активности зависит течение многих последующих реакций. Поэтому они часто называются ключевыми ферментами.
Общий принцип аллостерической регуляции
В качестве отрицательного регулятора может выступать конечный или промежуточный метаболит биохимического процесса или продукт данной реакции, т.е включается механизм обратной отрицательной связи. Если регуляторами являются начальный метаболит или субстрат реакции, то говорят о прямой регуляции, она может быть как положительной, так и отрицательной. Также регулятором могут быть метаболиты биохимических путей, каким то образом связанных с данной реакцией.
Регуляция фосфофруктокиназы конечным продуктом
Например, фермент энергетического окисления глюкозы, фосфофруктокиназа, регулируется промежуточными и конечными продуктами этого распада. При этом АТФ, лимонная кислота, фруктозо-1,6-дифосфат являются ингибиторами, а фруктозо-6-фосфат и АМФ – активаторами фермента.
Еще примеры:
- В большинстве клеток организма (кроме печени) при регуляции синтеза холестерола аллостерическим ингибитором ключевого фермента этого процесса ГМГ-КоА-редуктазы выступает сам холестерол, что быстро и точно регулирует его количество,
- Фермент ЦТК изоцитрат-дегидрогеназа активируется при помощи АМФ и АДФ и ингибируется влияниями АТФ и НАДН.
6. Белок-белковое взаимодействие
Термин белок-белковое взаимодействие обозначает ситуацию, когда в качестве регулятора выступают не метаболиты биохимических процессов, а специфичные белки. В целом ситуация схожа с аллостерическим механизмом: после влияния каких-либо факторов на специфичные белки изменяется активность этих белков, и они, в свою очередь, воздействуют на нужный фермент.
1. К примеру, мембранный фермент аденилатциклаза является чувствительным к воздействию мембранного G-белка, который сам активируется при действии на клетку некоторых гормонов (например, адреналина и глюкагона).
Упрощенная схема активации аденилатциклазы
Более подробно механизм активации G-белка можно посмотреть здесь.
2. Еще примером белок-белкового взаимодействия может быть регуляция активности протеинкиназы А через механизм ассоциации-диссоциации.
Протеинкиназа А является тетрамерным ферментом, состоящим из 2 каталитических (С) и 2 регуляторных (R) субъединиц. Активатором для протеинкиназы А является цАМФ. Присоединение цАМФ к регуляторным субъединицам фермента вызывает их отхождение от каталитических субъединиц. Каталитические субъединицы при этом активируются.
Активация протеинкиназы А при помощи цАМФ
7. Ковалентная (химическая) модификация
Ковалентная модификация заключается в обратимом присоединении или отщеплении определенной группы, благодаря чему изменяется активность фермента. Чаще всего такой группой является фосфорная кислота, реже метильные и ацетильные группы. Фосфорилирование фермента происходит по остаткам серина и тирозина. Присоединение фосфорной кислоты к белку осуществляют ферменты протеинкиназы, отщепление – протеинфосфатазы.
Изменение активности фермента
при фосфорилировании-дефосфорилировании
Ферменты могут быть активны как в фосфорилированном, так и в дефосфорилированном состоянии.
Например, в мышцах ферменты гликогенфосфорилаза и гликогенсинтаза
- при нагрузке фосфорилируются, при этом фосфорилаза гликогена становится активной и начинает расщепление гликогена и сжигание глюкозы, а гликогенсинтаза при этом неактивна.
- во время отдыха при синтезе гликогена оба фермента дефосфорилируются, синтаза при этом становится активной, фосфорилаза – неактивной.
Зависимость активности ферментов обмена
гликогена от наличия в структуре фосфорной кислоты
Лекарства обычно ингибируют ферменты
В медицине активно разрабатываются и используются соединения, изменяющие активность ферментов с целью регуляции скорости метаболических реакций и уменьшения синтеза определенных веществ в организме.
Подавление активности ферментов обычно называют ингибированием, однако это не всегда корректно. Ингибитором называется вещество, вызывающее специфичное снижение активности фермента. Таким образом, неорганические кислоты и тяжелые металлы ингибиторами не являются, а являются инактиваторами, так как снижают активность многих ферментов, т.е. действуют неспецифично.
В научной деятельности для более точного описания процессов ингибирования пользуются кинетикой Михаэлиса-Ментен и ее терминами — максимальная скорость (Vmax) и константа Михаэлиса (Km).
Ингибирование ферментов
Можно выделить два основных направления ингибирования
- по прочности связывания фермента с ингибитором ингибирование бывает обратимым и необратимым.
- по отношению ингибитора к активному центру фермента ингибирование делят на конкурентное и неконкурентное.
Необратимое ингибирование
При необратимом ингибировании происходит связывание или разрушение функциональных групп фермента, необходимых для проявления его активности.
Например, вещество диизопропилфторфосфат прочно и необратимо связывается с гидроксигруппой серина в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы, гидролизующей ацетилхолин в нервных синапсах. Ингибирование этого фермента предотвращает распад ацетилхолина в синаптической щели, в результате чего медиатор продолжает оказывать воздействие на свои рецепторы, что бесконтрольно усиливает холинергическую регуляцию.
Аналогично диизопропилфторфосфат ингибирует химотрипсин и другие протеазы, имеющие в активном центре серин (сериновые протеазы).
NB! Диизопропилфторфосфат относится к нервно-паралитическим ядам, аналогичным образом действуют боевые фосфоорганические вещества (зарин, зоман). Сюда же относится вещество «малатион», включенный в инсектициды (карбофос, дихлофос) и превращающийся в организме насекомых в ингибитор ацетилхолинэстеразы, а в организме животных и человека разрушающийся до безвредных продуктов.
Механизм необратимого ингибирования ацетилхолинэстеразы
Еще один пример связан с ингибированием ацетилсалициловой кислотой (аспирином) ключевого фермента синтеза простагландинов – циклооксигеназы. Эта кислота входит в состав противовоспалительных средств и используется при воспалительных заболеваниях и лихорадочных состояниях. Присоединение ацетильной группы к гидроксильной группе серина в активном центре фермента вызывает инактивацию последнего и прекращение синтеза простагландинов.
Механизм необратимого ингибирования циклооксигеназы
Третьим показательным примером необратимого ингибирования является влияние антибиотика пенициллина на фермент транспептидазу, сшивающую цепи пептидогликана как последний шаг в синтезе клеточной стенки бактерий.
Обратимое ингибирование
При обратимом ингибировании происходит непрочное связывание ингибитора с функциональными группами фермента, вследствие чего активность фермента постепенно восстанавливается.
Примером обратимого ингибитора может служить прозерин, связывающийся с ферментом ацетилхолинэстеразой в ее активном центре. Группа ингибиторов холинэстеразы (прозерин, дистигмин, галантамин) используется при миастении, после энцефалита, менингита, травм ЦНС.
Конкурентное ингибирование
При таком виде ингибирования ингибитор по своей структуре похож на субстрат фермента. Поэтому он соперничает с субстратом за активный центр (за контактный участок), что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и нарушению катализа. В этом состоит особенность конкурентного ингибирования – возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата. При данном ингибировании максимальная скорость реакции остается вполне достижимой при создании высоких концентраций субстрата.
Например:
1. Ингибирование фермента цикла трикарбоновых кислот сукцинат-дегидрогеназы малоновой кислотой, структура которой схожа со структурой субстрата этого фермента – янтарной кислоты (сукцината).
Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы
2. Также к конкурентным ингибиторам относят антиметаболиты или псевдосубстраты, например, антибактериальные средства сульфаниламиды, схожие по структуре с пара-аминобензойной кислотой, компонентом фолиевой кислоты. При лечении сульфаниламидами в бактериальной клетке возникает конкуренция между сульфаниламидом и пара-аминобензойной кислотой при синтезе дигидрофолиевой кислоты, что и вызывает лечебный эффект.
3. В качестве других примеров лекарственных конкурентных ингибиторов можно привести
- ингибитор синтеза холестерина ловастатин, обратимо ингибирующий ГМГ-S-КоА-редуктазу,
- противоопухолевый препарат метотрексат, необратимо подавляющий дигидрофолатредуктазу,
- непрямой антикоагулянт дикумарол, конкурент витамина К,
- антигипертензивный препарат метил-ДОФА, подавляющий активность ДОФА-декарбоксилазы,
- средство для лечения подагры аллопуринол, ингибирующий ксантиноксидазу.
Неконкурентное ингибирование
Данный вид ингибирования связан с присоединением ингибитора не в активном центре, а в другом месте молекулы. Но при этом меняется структура активного центра и связь с субстратом становится невозможной. Это может быть аллостерическое ингибирование, когда активность фермента снижается естественными модуляторами, или связывание с ферментом каких-либо веществ вне активного и аллостерического центра. Например:
- синильная кислота (цианиды) связывается с гемовым железом ферментов дыхательной цепи и блокирует клеточное дыхание,
- связывание ионов тяжелых металлов (Cu2+, Hg2+, Ag+) с SH-группами белков.
Особенностью неконкурентного ингибитора является его способность связываться с ферментом независимо от субстрата, т.е. изменение концентрации субстрата никак не влияет на образование комплекса фермент-ингибитор.
Бесконкурентное ингибирование
В этом случае ингибитор связывается в активном центре с фермент-субстратным комплексом. Повышение концентрации субстрата, увеличивая количество фермент-субстратного комплекса, усиливает и связывание ингибитора с ним. Таким образом, бесконкурентное ингибирование более сложно, чем другие типы ингибирования.
На примере пенициллина также рассматривается т.н. суицидное ингибирование. При нем субстрат первоначально связывается с ферментом обратимо, а затем образует устойчивое ковалентное соединение с активным центром, что приводит к ингибированию активности фермента.
Смешанное ингибирование
При таком ингибировании ингибитор способен присоединяться везде – не только в активном центре, но и в других частях молекулы. Но после этого фермент еще способен частично сохранять свою активность. Примером является влияние мертиолата (ртутьорганическое вещество) на сахаразу грибов микромицетов для подавления их роста.
Ингибирование описывает кинетика Михаэлиса-Ментен
Кинетика конкурентного ингибирования
При таком виде ингибирования ингибитор конкурирует с субстратом за активный центр (за контактный участок), что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и снижению катализа. Используя терминологию кинетики Михаэлиса-Ментен можно сказать, что конкурентный ингибитор уменьшает сродство фермента к субстрату, повышая константу Михаэлиса (Km), максимальная скорость реакции (Vmax) остается при этом неизменнной.
Зависимость в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат. Конкурентный ингибитор увеличивает Кm и не изменяет Vmax.
График конкурентного ингибирования в координатах Михаэлиса-Ментен
График конкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка
Кинетика неконкурентного ингибирования
Особенностью неконкурентного ингибитора является его способность связываться с ферментом не в активном центре, и изменение концентрации субстрата никак не влияет на это связывание. В то же время неконкурентный ингибитор не мешает связыванию субстрата с активным центром. В результате формируется тройной комплекс фермент-субстрат-ингибитор (E-S-I), в котором фермент уже не способен изменить свою конформацию и обеспечить проведение реакции. Количество «работоспособных» комплексов E-S при этом снижается.
Максимальная скорость реакции (Vmax) при неконкурентном ингибировании снижается, константа Михаэлиса (Km) не изменяется, т.е. добавление дополнительного субстрата не может повлиять на состояние активного центра и работу фермента.
Зависимость в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс. Неконкурентный ингибитор не изменяет Кm и снижает Vmax.
График неконкурентного ингибирования
в координатах Михаэлиса-Ментен
График неконкурентного ингибирования
в координатах Лайнуивера-Берка
Кинетика бесконкурентного ингибирования
Бесконкурентный ингибитор способен связываться только с уже образовавшимся комплексом E-S, но не со свободным ферментом. Связывание происходит либо на молекуле субстрата, либо с ферментом, уже начавшем катализ и изменившим свою конформацию. Образовавшийся тройной комплекс E-S-I также непродуктивен.
Максимальная скорость реакции (Vmax) и константа Михаэлиса (Km) при бесконкурентном ингибировании снижаются. Добавление дополнительного субстрата не может повлиять на состояние активного центра и работу фермента.
Есть патологии, при которых ферменты не работают
В случае, если фермент не может выполнять свою функцию, говорят об энзимопатологии (энзимопатии).
Энзимопатологии (энзимопатии) – состояния, связанные с патологическим увеличением или снижением активности ферментов. Наиболее часто встречается снижение их активности с нарушением соответствующих метаболических процессов. При энзимопатологии клиническое значение может иметь
- накопление субстрата реакции, например: фенилаланина при фенилкетонурии, свободного билирубина при физиологических желтухах новорожденных, некоторых жиров при болезнях лизосомального накопления (липидозы),
- недостаток продукта, например: меланина при альбинизме, катехоламинов при паркинсонизме,
- обе особенности одновременно, как при гликогенозах, сопровождающихся гипогликемией при избытке гликогена в печени.
По характеру нарушения выделяют первичные и вторичные энзимопатии.
Первичные (наследственные) энзимопатии связаны с генетическим дефектом и наследственным снижением активности. Например, фенилкетонурия связана с дефектом фенилаланин-4-монооксигеназы, которая превращает фенилаланин в тирозин. В результате накапливаются аномальные метаболиты фенилаланина, оказывающие сильный токсический эффект. Заболевание подагра связано с дефектом ферментов метаболизма пуриновых оснований и накоплением мочевой кислоты.
Кроме указанных, примером первичных энзимопатий являются галактоземия, недостаточность лактазы и сахаразы, различные липидозы и гликогенозы.
Вторичные (приобретенные) энзимопатии возникают как следствие заболеваний органов, вирусных инфекций и т.п., что приводит к нарушению синтеза фермента или условий его работы, например, гипераммониемия при заболеваниях печени, при которых ухудшается синтез мочевины и в крови накапливается аммиак. Другим примером может служить недостаточность ферментов желудочно-кишечного тракта при заболеваниях желудка, поджелудочной железы или желчного пузыря.
Недостаток витаминов и их коферментных форм также является причиной приобретенных ферментопатий.
Ферменты востребованы в медицине
Использование ферментов в медицине происходит по четырем направлениям:
- энзимодиагностика,
- энзимотерапия,
- использование ферментов в медицинских технологиях и промышленности,
- применение ингибиторов ферментов.
Энзимодиагностика
Энзимодиагностика – это исследование активности ферментов плазмы крови, мочи, слюны с целью диагностики тех или иных заболеваний (подробнее). В основе энзимодиагностики лежат два факта:
- Заболевание органа приводит к понижению синтеза ферментов в клетках. Если некоторые ферменты секретируются клетками наружу, то их активность в биологической жидкости снижается. Примером является снижение активности факторов гемостаза, церулоплазмина и псевдохолинэстеразы в крови при заболеваниях печени.
- При воспалении или некрозе ткани происходит разрушение клеток, в результате чего внутриклеточные ферменты (органоспецифичные) оказываются в плазме крови или в моче, их активность здесь повышается.
Примером для второго случая может служить фермент лактатдегидрогеназа, определение его активности в сыворотке крови необходимо при заболеваниях сердца, печени, скелетной мускулатуры. Увеличение активности α-амилазы в плазме крови и моче наблюдается при воспалительных процессах в поджелудочной и слюнных железах.
В то же время заболевания тех или иных органов всегда сопровождаются специфичным «ферментативным профилем». Например, инфаркт миокарда сопровождается увеличением активности лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, аспартатаминотрансферазы .
Энзимотерапия
Энзимотерапия – это использование ферментов в качестве лекарственных средств.
Самыми распространенными ферментативными препаратами являются многочисленные комплексы пищеварительных ферментов (Ацидин-пепсин, Фестал, Энзистал, Панкреатин, Мезим форте, Воб-энзим, Креон и т.п.), отличающиеся по источнику ферментов (животная или растительная основа) и содержащие пепсин, трипсин, амилазу, лактазу и т.п., и используемые для заместительной терапии при нарушениях переваривания веществ в желудочно-кишечном тракте.
Тканевой фермент гиалуронидаза нужна организму для обратимого изменения проницаемости межклеточного вещества, в основе которого находится гиалуроновая кислота. Лекарственную форму гиалуронидазы – лидазу – вводят для размягчения рубцов, появления подвижности в суставах, рассасывания гематом. Коллагеназу применяют для ускорения отторжения некротизированных тканей, для очистки трофических язв.
Цитохром с – белок, участвующий в процессах тканевого дыхания. Его применяют при асфиксии новорожденных, при гипоксии тканей – астматические состояния, сердечная недостаточность, нарушения мозгового и периферического кровообращения и т.п.
Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов, также при нанесении на рану они разжижают гной, при ингаляциях уменьшают вязкость слизи, деполимеризуя нуклеиновые кислоты в мокроте.
Стрептокиназа и урокиназа используются как активаторы фибринолиза при тромбозах. Трипсин ингалируют при бронхолегочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты. Фицин используется в фармацевтической промышленности в качестве добавки к зубным пастам для удаления зубного налета.
Использование ферментов в медицинских технологиях
Специфичность ферментов к определенным субстратам широко нашла применение в настоящее время в лабораторной диагностике.
- многие лабораторные методы основаны на взаимодействии добавляемого извне фермента с определяемым соединением. В результате возникает специфичный продукт реакции, после определения содержания последнего судят о концентрации искомого вещества (глюкозооксидазный, холестеролоксидазный методы),
- иммуноферментные методы, основанные на образовании тройного комплекса фермент-антиген-антитело. Определяемое вещество не является субстратом фермента, но является антигеном. Фермент может присоединять этот антиген вблизи от активного центра. Если в среде есть антиген, то при добавлении антител и формировании тройного комплекса активность фермента изменяется. Активность фермента измеряют любым способом, при этом активность фермента зависит от количества антигена (определяемого вещества).
Использование ингибиторов ферментов
Весьма широко применяются в настоящее время ингибиторы ферментов, чтобы остановить биохимический процесс, и этим предотвратить накопление патологических продуктов процесса или способствовать сохранению необходимых веществ.
Ингибиторы протеаз (контрикал, гордокс) при панкреатитах используются при состояниях, когда происходит активирование пищеварительных ферментов в протоках и клетках поджелудочной железы.
Ингибиторы холинэстеразы (физостигмин, прозерин) приводят к накоплению нейромедиатора ацетилхолина в синапсах и показаны при миастении, двигательных и чувствительных нарушениях при невритах, радикулитах, психогенной импотенции.
Препараты, содержащие ингибиторы моноаминоксидазы (наком, мадопар), повышают выработку нейромедиаторов катехоламинов в ЦНС при лечении паркинсонизма. Подавление активности моноаминооксидазы (разрушающей катехоламины) сохраняет нормальную передачу сигналов в нервной системе.
Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (каптоприл, эналаприл и т.п.) используются как антигипертензивное средство и вызывают расширение периферических сосудов, уменьшение нагрузки на миокард, снижение артериального давления.
Аллопуринол – ингибитор ксантиноксидазы, фермента катаболизма пуринов, требуется для снижения образования мочевой кислоты и подавления развития гиперурикемии и подагры.
Ингибиторы гидроксиметилглутарил-SКоА-редуктазы (ловастатин, флувастатин, аторвастатин) применяются для снижения синтеза холестерола при атеросклерозе, заболеваниях сердечно-сосудистой системы, дислипопротеинемиях.
Ингибитор карбоангидразы (ацетазоламид) используется как мочегонное средство при лечении глаукомы, отеков, эпилепсии, алкалозах и горной болезни.
И в пищевой промышленности не обходятся без ферментов
Химозин используется при производстве твердых сортов сыра. По старой технологии химозин получали из экстрактов ткани желудка новорожденных телят. В настоящее время его получают от трансгенных овец, которые синтезируют химозин в молоке. Для процесса сыроварения белок можно не выделять, а использовать просто в составе молока.
Амилазы используются в пищевой промышленности для гидролиза крахмала при производстве спирта, вин, в пивоварении, хлебопечении, изготовлении кондитерских изделий и детского питания.
Инвертаза (сахараза) используется при производстве кондитерских изделии – расщепление густой массы сахарозы, включенной внутрь шоколадной оболочки, приводит к образованию жидкого сиропа глюкозы и фруктозы.
β-Галактозидаза – производство безлактозного молока, освобождение молочной сыворотки от лактозы, приготовление мороженого.
Целлюлазы используются для изготовления растворимого кофе, морковного джема, улучшения консистенции грибов и овощей, обработки цитрусовых.
Пектиназы – необходимы для осветления вин и фруктовых соков, обработка цитрусовых.
Микробные протеазы – обеспечивают сыроварение, ускорение созревания теста, производство крекеров.
Пепсин, папаин используются для осветления пива.
Фицин, трипсин, бромелайн нужны для ускорения маринования рыбы, удаления мяса с костей.
Трансглутаминаза используется в пищевой промышленности как «мясной клей» при производстве продуктов смешанного состава – молочно-растительные продукты, склеивание мяса, морепродуктов и рыбы, связывание животных белков с глютеном пшеничной клейковины. Использование трансглутаминазы уплотняет продукт и повышает его эластичность, сочность, кусаемость. Например, c ее помощью изготавливают фальшивые креветки и крабовые палочки из перемолотой и отжатой рыбной массы, сосиски и сардельки, различные колбасы.
Существуют шесть классов ферментов
В 1961 г в Москве V Международный биохимический союз принял современную классификацию ферментов. В соответствии с этой классификацией все ферменты делятся:
- на классы – по типу катализируемой реакции,
- каждый класс подразделяется на подклассы – по природе атакуемой химической группы,
- подклассы делятся на подподклассы – по характеру атакуемой связи или по природе акцептора.
Выделяют 6 классов ферментов:
- I класс – Оксидоредуктазы (подробно)
- II класс – Трансферазы (подробно)
- III класс – Гидролазы (подробно)
- IV класс – Лиазы (подробно)
- V класс – Изомеразы (подробно)
- VI класс – Лигазы (подробно)
Каждому ферменту присвоен четырехзначный классификационный номер, включающий класс, подкласс, подподкласс и порядковый номер в подподклассе.
Например, алкогольдегидрогеназа имеет номер КФ 1.1.1.1. – это оксидоредуктаза, действует на ОН-группу донора с НАД в качестве акцептора с первым порядковым номером в своем подподклассе; лактатдегидрогеназа – КФ 1.1.1.27, действует на ОН-группу донора с НАД в качестве акцептора с порядковым номером 27 в своем подподклассе
Чтобы дать ферменту название существует два способа:
1. Систематическое название – согласно современной классификации. Часто такое название длинно и сложно для использования, поэтому как производное систематического названия у многих ферментов имеется одно или несколько рабочих названий.
2. Тривиальное название – название, сложившееся исторически, например, пепсин, трипсин, папаин, бромелайн, химозин. Для некоторых ферментов (чаще для гидролаз) к названию субстрата добавляется окончание «-аза» – инвертаза, уреаза, амилаза, лактаза, липаза. Тем не менее и у таких ферментов имеется систематическое название.
Оксидоредуктазы
Ферменты этого класса катализируют окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Класс насчитывает 22 подкласса. Коферментами этого класса являются НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, убихинон, глутатион, липоевая кислота.
Примером подклассов могут служить ферменты, действующие на СН-ОН-группу доноров, на СH-СН-группу доноров, на СН-NН2-группу доноров, на гемсодержащие доноры.
NB! Если рассматривать все подклассы, то в них выделяются группы ферментов, действующие на:
1.1. CH-OH группу доноров;
1.2. альдегидную или кетоновую группу доноров;
1.3. CH-СH группу доноров;
1.4. CH-NH2 группу доноров;
1.5. CH-NН группу доноров;
1.6. НАДH или НАДФН в качестве доноров;
1.8. содержащие серу группы доноров;
1.9. гем-содержащие доноры;
1.10. дифенолы в качестве доноров;
1.11. пероксид водорода в качестве акцептора;
1.11. водород в качестве донора;
1.13. один донор с включением молекулярного кислорода;
1.14. два донора с включением молекулярного кислорода;
1.15. супероксидные радикалы в качестве акцептора;
1.17. СН2 группу доноров;
1.18. ферредоксин в качестве донора;
1.19. флаводоксин в качестве донора;
1.20. фосфор или мышьяк в качестве донора;
1.21. на вещества Х-Н и Y-Н с образованием X-Y-связи;
1.22. галоген в качестве донора;
1.97. другие оксидоредуктазы.
На подподклассы деление производится в зависимости от акцептора – НАД+ или НАДФ+ (1.1.1., 1.2.1., 1.3.1., 1.4.1.), дисульфиды (1.2.4.), кислород (1.3.3.). Например, каталаза (КФ 1.11.1.6), пероксидаза (КФ 1.11.1.7).
Наиболее распространены следующие рабочие названия оксидоредуктаз:
1. Дегидрогеназы – оксидоредуктазы, катализирующие дегидрирование субстрата с использованием в качестве акцептора водорода любых молекул, кроме кислорода.
2. Если перенос водорода от молекулы донора трудно доказуем, то такие оксидоредуктазы называют редуктазами.
3. Оксидазы – оксидоредуктазы, катализирующие окисление субстратов с молекулярным кислородом в качестве акцептора электронов без включения кислорода в молекулу субстрата.
4. Монооксигеназы – оксидоредуктазы, катализирующие внедрение одного атома кислорода в молекулу субстрата с молекулярным кислородом в качестве донора кислорода.
5. Диоксигеназы – оксидоредуктазы, катализирующие внедрение 2 атомов кислорода в молекулу субстрата с молекулярным кислородом в качестве донора кислорода.
6. Пероксидазы – оксидоредуктазы, катализирующие реакции с пероксидом водорода в качестве акцептора электронов.
Систематическое название образуется:
Донор электронов : акцептор электронов – оксидоредуктаза.
Пример 1
Характеристика фермента
Систематическое название | Алкоголь:НАД-оксидоредуктаза |
Рабочее название | Алкогольдегидрогеназа |
Класс | 1. Оксидоредуктазы |
Подкласс | 1.1. Действующие на СН-ОН-группу доноров |
Подподкласс | 1.1.1. с НАД+ или НАДФ+ в качестве акцептора |
Классификационный номер | КФ 1.1.1.1. |
Кофакторы | Никотинамидадениндинуклеотид. Железо или цинк. |
Пример 2
Характеристика фермента
Систематическое название | Сукцинат:ФАД-оксидоредуктаза |
Рабочее название | Сукцинатдегидрогеназа |
Класс | 1. Оксидоредуктазы |
Подкласс | 1.3. Действующие на СН-СН-группу доноров |
Подподкласс | 1.3.99. с ФАД+ в качестве акцептора |
Классификационный номер | КФ 1.3.99.1. |
Кофакторы | Флавинадениндинуклеотид |
Пример 3
Характеристика фермента
Систематическое название | Фенилаланин.Тетрагидробиоптерин:кислород-оксидоредуктаза |
Рабочее название | Фенилаланин-4-монооксигеназа |
Класс | 1. Оксидоредуктазы |
Подкласс | 1.14. Два донора с включением молекулярного кислорода |
Подподкласс | 1.14.16. С восстановленным птеридином в качестве донора и включением одного атома кислорода |
Классификационный номер | КФ 1.14.16.1 |
Кофакторы | Тетрагидробиоптерин. Железо. |
Трансферазы
Трансферазы катализируют реакции переноса различных групп от одного субстрата (донор) к другому (акцептор), участвуют в реакциях взаимопревращения различных веществ, обезвреживания природных и чужеродных соединений. Коферментами являются пиридоксальфосфат, коэнзим А, тетрагидрофолиевая кислота, метилкобаламин. Класс подразделяется на 9 подклассов в зависимости от строения переносимых групп.
Примером подклассов являются ферменты, переносящие одноуглеродные фрагменты, альдегидные или кетоостатки, ацильные остатки, азотсодержащие группы, фосфорсодержащие группы.
NB! Если рассматривать все подклассы, то в них выделяются группы ферментов в зависимости от состава переносимой группы
2.1. переносящие одноуглеродные фрагменты;
2.2. переносящие альдегидные и кетогруппы;
2.3. переносящие ацильные группы;
2.4. переносящие гликозильные группы;
2.5. переносящие неметильные алкильные и арильные группы;
2.6. переносящие азотсодержащие группы;
2.7. переносящие фосфорсодержащие группы.
2.8. переносящие сульфосодержащие группы;
2.9. переносящие селенсодержащие группы.
На подподклассы деление производится также в зависимости от вида переносимой группы – метил (2.1.1.), карбоксиметил или формил (2.1.2.), амино-группы (2.6.1.).
Часто встречается рабочее название трансфераз – киназы. Это трансферазы, катализирующие перенос фосфата от АТФ на субстрат (моносахариды, белки и др), т.е. фосфотрансферазы.
Систематическое название образуется:
Донор группы : акцептор группы – переносимая группа трансфераза.
Пример 1
Характеристика фермента
| Систематическое название | АТФ:D-гексоза-6-фосфотрансфераза |
| Рабочее название | Гексокиназа |
| Класс | 2. Трансферазы |
| Подкласс | 2.7. Переносящие фосфорсодержащие группы |
| Подподкласс | 2.7.1. Со спиртовой группой в качестве акцептора |
| Классификационный номер | КФ 2.7.1.1. |
| Кофакторы | Магний |
Пример 2
Характеристика фермента
| Систематическое название | АТФ:фруктозо-6-фосфат-фосфотрансфераза |
| Рабочее название | Фосфофруктокиназа |
| Класс | 2. Трансферазы |
| Подкласс | 2.7. Переносящие фосфорсодержащие группы |
| Подподкласс | 2.7.1. Со спиртовой группой в качестве акцептора |
| Классификационный номер | КФ 2.7.1.11. |
Пример 3
Характеристика фермента
| Систематическое название | L-Аспартат:2-оксоглутарат-аминотрансфераза |
| Рабочее название | Аспартатаминотрансфераза |
| Класс | 2. Трансферазы |
| Подкласс | 2.6. Переносящие азотсодержащие группы |
| Подподкласс | 2.6.1. Аминотрансферазы |
| Классификационный номер | КФ 2.6.1.1. |
| Кофактор | Пиридоксальфосфат |
Пример 4
Характеристика фермента
| Систематическое название | 5-метилтетрагидрофолат:L-гомоцистеин S-метилтрансфераза |
| Рабочее название | Метионинсинтаза |
| Класс | 2. Трансферазы |
| Подкласс | 2.1. Переносящие одноуглеродные фрагменты |
| Подподкласс | 2.1.1. Метилтрансферазы |
| Классификационный номер | 2.1.1.13. |
| Кофактор | Кобаламин. Цинк. |
Гидролазы
Гидролазы – ферменты, осуществляющие разрыв внутримолекулярных связей в субстрате путем присоединения элементов Н2О, подразделяются на 13 подклассов. Ввиду сложности многих субстратов у ряда ферментов сохранены тривиальные названия, например, пепсин, трипсин. Коферменты отсутствуют.
Гидролазы широко представлены ферментами желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин, липаза, амилаза и другие) и лизосомальными ферментами. Осуществляют распад макромолекул, образуя легко адсорбируемые мономеры.
Примером подклассов служат группы ферментов, действующие на сложные эфиры, на простые эфиры, на пептиды, на углерод-углеродные связи.
NB! Если рассматриватиь вcе подклассы, то в них выделяют группы ферментов, катализирующие гидролиз:
3.1. сложных эфиров;
3.2. О-гликозидов;
3.3. простых эфиров;
3.4. пептидов;
3.5. не пептидных азот-углеродных связей;
3.6. ангидридов кислот;
3.7. углерод-углеродных связей;
3.8. связей с участием галогена;
3.9. связей фосфор-азот;
3.10. связей сера-азот;
3.11. связей углерод-фосфор;
3.12. связей сера-сера;
3.13. связей углерод-сера.
Среди подподклассов выделяют гидролазы карбоновых кислот (3.1.1.), гидролазы фосфомоноэфиров (3.1.3.).
Исторически названия гидролаз складывались из названия субстрата с окончанием «-аза» – коллагеназа, амилаза, липаза, ДНК-аза. Наиболее часто встречаются следующие рабочие названия гидролаз:
1. Эстеразы – гидролиз сложноэфирных связей.
2. Липазы – гидролиз нейтральных жиров (триацилглицеролов).
3. Фосфатазы – отщепление фосфорной кислоты от веществ.
4. Гликозидазы – гидролизуют О- и S-гликозидные связи.
5. Протеазы и пептидазы – гидролиз белков и пептидов.
6. Нуклеазы – гидролиз нуклеиновых кислот.
Систематическое название образуется:
Гидролизуемый субстрат : отделяемая группа гидролаза.
Пример 1
Характеристика фермента
| Систематическое название | Триацилглицерол:ацилгидролаза |
| Рабочее название | ТАГ-липаза |
| Класс | 3. Гидролазы |
| Подкласс | 3.1. Действующие на сложные эфиры |
| Подподкласс | 3.1.1. Гидролазы карбоновых кислот |
| Классификационный номер | КФ 3.1.1.3. |
Пример 2
Характеристика фермента
| Систематическое название | L-глутамин:амидгидролаза |
| Рабочее название | Глутаминаза |
| Класс | 3. Гидролазы |
| Подкласс | 3.5. Действующие на связи углерод-азот (не пептидные) |
| Подподкласс | 3.5.1. Действующие в линейных амидах |
| Классификационный номер | КФ 3.5.1.2. |
Пример 3
Характеристика фермента
| Систематическое название | α-D-глюкозид:глюкогидролаза |
| Рабочее название | Мальтаза |
| Класс | 3. Гидролазы |
| Подкласс | 3.2. Гликозидазы |
| Подподкласс | 3.2.1. Гидролизующие О-гликозидные связи |
| Классификационный номер | КФ 3.2.1.20. |
Пример 4
Характеристика фермента
| Систематическое название | Ацетилхолин:ацетил-гидролаза |
| Рабочее название | Холинэстераза |
| Класс | 3. Гидролазы |
| Подкласс | 3.1. Действующие на сложные эфиры |
| Подподкласс | 3.1.1. Гидролазы карбоновых кислот |
| Классификационный номер | КФ 3.1.1.7. |
Лиазы
Лиазы – ферменты, катализирующие разрыв С-О, С-С, C-N и других связей, а также обратимые реакции отщепления различных групп негидролитическим путем. Выделяют 7 подклассов. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту двойной связи. Лиазы являются сложными ферментами. Коферментами служат пиридоксальфосфат, тиаминдифосфат, участвует магний, кобальт.
Ферменты делятся на подклассы в зависимости от природы атакуемой связи. Примером являются ферменты, действующие на углерод-углеродные связи, углерод-кислородные связи, углерод-азотные связи.
NB! Если рассматривать все подклассы, то в них выделяются:
4.1. углерод-углерод лиазы;
4.2. углерод-кислород лиазы;
4.3. углерод-азот лиазы;
4.4. углерод-сера лиазы;
4.5. углерод-галоген лиазы;
4.6. фосфор-кислород лиазы;
4.7. углерод-фосфор лиазы.
Среди подподклассов выделяют, например, карбокси-лиазы (4.1.1.), гидро-лиазы 4.2.1.).
Систематическое название образуется:
Расщепляемый субстрат : отделяемая группа – лиаза
Пример 1
Характеристика фермента
| Систематическое название | АТФ:дифосфат-лиаза (циклизующая) |
| Рабочее название | Аденилатциклаза |
| Класс | 4. Лиазы |
| Подкласс | 4.6. Фосфор-кислород-лиазы |
| Подподкласс | 4.6.1. Фосфор-кислород-лиазы |
| Классификационный номер | КФ 4.6.1.1. |
Пример 2
Характеристика фермента
| Систематическое название | Гистидин:карбокси-лиаза |
| Рабочее название | Гистидин-декарбоксилаза |
| Класс | 4. Лиазы |
| Подкласс | 4.1. Углерод-углерод-лиазы |
| Подподкласс | 4.1.1. Карбокси-лиазы |
| Классификационный номер | КФ 4.1.1.22. |
| Кофактор | Пиридоксальфосфат |
Пример 3
Характеристика фермента
| Систематическое название | Малат:гидро-лиаза (по обратной реакции() |
| Рабочее название | Фумараза |
| Класс | 4. Лиазы |
| Подкласс | 4.2. Углерод-кислород-лиазы |
| Подподкласс | 4.2.1. Гидро-лиазы |
| Классификационный номер | КФ 4.2.1.2. |
Пример 4
Характеристика фермента
| Систематическое название | 2-оксокислота:карбокси-лиаза |
| Рабочее название | Пируватдекарбоксилаза |
| Класс | 4. Лиазы |
| Подкласс | 4.1. Углерод-углерод-лиазы |
| Подподкласс | 4.1.1.Карбокси-лиазы |
| Классификационный номер | КФ 4.1.1.1. |
| Кофактор | Тиаминдифосфат |
Изомеразы
Изомеразы – ферменты, катализирующие изомерные превращения в пределах одной молекулы. Изомеразы – сложные ферменты. К их коферментам относятся пиридоксальфосфат, дезоксиаденозилкобаламин, глутатион, фосфаты моносахаридов (глюкозо-1,6-дифосфат) и др.
Выделяют подклассы изомераз в зависимости от типа реакции. Например, в первый подкласс выделяют рацемазы (обратимое превращение L- и D-стереоизомеров) и эпимеразы (превращения изомеров, имеющих более одного центра асимметрии, например, α-D-глюкозу в β-D-глюкозу), мутазы (перенос химических групп внутри молекулы, например, фосфоглюкомутаза превращает глюкозо-1-фосфат в глюкозо-6-фосфат).
NB! Если рассматривать все подклассы, то изомеразы делятся по типу изомеризации на:
5.1. рацемазы и эпимеразы;
5.2. цис-транс изомеразы;
5.3. внутримолекулярные оксидоредуктазы;
5.4. внутримолекулярные трансферазы – мутазы;
5.5. внутримолекулярные лиазы.
Среди подподклассов выделяют, например: действующие на аминокислоты и их производные (5.1.1.), на углеводы и их производные (5.1.3.), перемещающие двойные (С=С) связи (5.3.3.).
Систематическое название образуется:
Субстрат – [ ] – реакция, где [ ] – обозначение, отражающее суть реакции, например, «номер изменяемого атома углерода», изменение «цис-транс», изменение «кето-енол», изменение «альдозо-кетозо».
Пример 1
Характеристика фермента
| Систематическое название | D-рибулозо-5-фосфат-3-эпимераза |
| Рабочее название | Рибулозофосфат 3-эпимераза |
| Класс | 5. Изомеразы |
| Подкласс | 5.1. Рацемазы и эпимеразы |
| Подподкласс | 5.1.3. Действующие на углеводы и их производные |
| Классификационный номер | КФ 5.1.3.1. |
Пример 2
Характеристика фермента
| Систематическое название | D-глицеральдегид-3-фосфат-альдозо-кетозо-изомераза |
| Рабочее название | Триозофосфат-изомераза |
| Класс | 5. Изомеразы |
| Подкласс | 5.3. Внутримолекулярные оксидоредуктазы |
| Подподкласс | 5.3.1. Катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз |
| Классификационный номер | КФ 5.3.1.1. |
Пример 3
Характеристика фермента
| Систематическое название | α-D-глюкозо-1,6-фосфомутаза |
| Рабочее название | Фосфоглюкомутаза |
| Класс | 5. Изомеразы |
| Подкласс | 5.4. Внутримолекулярные трансферазы |
| Подподкласс | 5.4.2. Фосфотрансферазы |
| Классификационный номер | КФ 5.4.2.2. |
| Кофактор | Глюкозо-1,6-дифосфат |
Лигазы
Лигазы (синтетазы) – ферменты, катализирующие присоединение друг к другу двух молекул с использованием энергии высокоэнергетических связей АТФ (или других макроэргов). Лигазы – сложные ферменты. Они содержат нуклеотидные (УТФ), биотиновые (витамин Н), фолиевые коферменты. Выделяют 6 подклассов.
Примером подклассов служат группы ферментов по виду образуемой связи: углерод-кислород (C–O), углерод-сера (C–S), углерод-азот (C–N), углерод-углерод (C–C).
NB! Если рассматривать класс в целом, то выделяют 6 подклассов ферментов, формирующих связи:
6.1. углерод-кислород;
6.2. углерод-сера;
6.3. углерод-азот;
6.4. углерод-углерод;
6.5. фосфор-кислород;
6.6. азот-металл.
Среди подподклассов выделяют ферменты, синтезирующие соединения типа кислота-тиол (6.2.1.), амиды (6.3.1.).
Систематическое название образуется:
Субстрат 1 : субстрат 2 – лигаза
Пример 1
Характеристика фермента
| Систематическое название | L-глутамат:аммиак-лигаза |
| Рабочее название | Глутаминсинтетаза |
| Класс | 6. Лигазы |
| Подкласс | 6.3. Образующие связи углерод-азот |
| Подподкласс | 6.3.1. Амид-синтетазы |
| Классификационный номер | КФ 6.3.1.2. |
Пример 2
Характеристика фермента
| Систематическое название | Пируват:карбокси-лигаза (АДФ-образующая) |
| Рабочее название | Пируваткарбоксилаза |
| Класс | 6. Лигазы |
| Подкласс | 6.4. Образующие связи углерод-углерод |
| Подподкласс | 6.4.1. Образующие связи углерод-углерод |
| Классификационный номер | КФ 6.4.1.1. |
| Кофактор | Биотин. Магний. Цинк. |
Пример 3
Характеристика фермента
| Систематическое название | Сукцинат:КоА-лигаза |
| Рабочее название | Сукцинил-КоА-синтетаза Сукцинат-тиокиназа |
| Класс | 6. Лигазы |
| Подкласс | 6.2. Образующие связи углерод-сера |
| Подподкласс | 6.2.1. Лигазы кислота-тиол |
| Классификационный номер | КФ 6.2.1.4. |